一、實驗目的 

掌握Hungate厭氧操作技能，掌握厭氧微生物的培養基配制和厭氧菌的富集、分離和純化方法。 

二、知識背景 

產甲烷菌（Mathanogens）是一類以產生大量甲烷氣體作為能量代謝的終產物的特殊原核微生物，廣泛存在于各種極端厭氧環境中。作為自然界碳素循環中厭氧生物處理的**后一個成員，該菌與其它菌群協同作用，將大量的有機物轉化成可再生能源，對自然界中的物質循環及當今社會能源危機中的能源替代問題具有極大的推動作用。 

產甲烷菌是一類嚴格的厭氧細菌，**今還未發現產甲烷菌具有超氧化物歧化酶和過氧化氫酶，產甲烷菌不能除去在生命代謝過程中產生的超氧化物、過氧化氫等氧化產物，這些氧化物可損害組成細胞的大分子，如F420因子，當F420處于氧化態時，即與酶蛋白分離而失活。因此，在對甲烷菌進行分離、培養以及操作過程中必須給予無氧的環境。 

產甲烷菌廣泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和動物的腸道、昆蟲的腸道、濕樹木、地熱泉水、深海火山口、水田和海洋的沉積物、沼澤等厭氧環境中都有產甲烷菌存在。 

三、原理 

產甲烷菌是一類必須生活在厭氧生境下并伴有甲烷產生的古生菌，其形態和生理、生化特性呈現明顯的多樣性。它生長的氧化還原電位約為-0.33V，一般**適生長溫度為30～40℃，**適pH為6.0～7.2。例如細胞形態有球狀、短桿狀、長桿狀、螺旋狀和絲狀等；Gram染色反應有陽性、陰性和不定性；產甲烷菌生長需要的營養與其它微生物一樣，需要碳源、氮源、無機鹽、生長因子等。生長所需碳源約有10多種，除CO2外，還有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有當產甲烷菌在利用H2作CO2還原劑以產生生物合成所需細胞物質，才能利用CO2作電子受體以產生ATP和CH4。 

四、實驗藥品、器材 1、藥品 

NH4Cl、MgCl2·6H2O、K2HPO4、KH2PO4、甲酸鈉、乙酸鈉、胰化酪蛋白、酵母膏、鹽酸半胱氨酸、刃天青、Na2S·9H2O、NaHCO3、氨三乙酸、MgSO4·7H2O、MnSO4·2H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、CoSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、ZnSO4·7H2O、KAl（SO4）2·12H2O、CuSO4·5H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、NiCl2·6H2O、Na2SeO3·5H2O、生物素、葉酸、鹽酸吡哆醇、二水鹽酸硫胺、核黃素、煙酸、D-泛酸鈣、維生素B12、對氨基苯甲酸、硫辛酸。 

2、儀器用具 

裝有分壓表和相應高純氣體的氮氣鋼瓶，氫氣鋼瓶，二氧化碳鋼瓶，銅柱和銅柱固定架，高壓滅菌鍋，厭氧管（15mL），厭氧瓶（50mL），異丁烯橡膠塞、光波爐、三角燒瓶（500mL、1000mL）、各種規格的定量注射器（1mL、2mL、5mL），9#針頭，酒精燈，酒精棉球，水樣取樣器、恒溫水浴鍋、恒溫培養箱，熒光顯微鏡，氣相色譜儀等。3、試劑及配制 

（1）1%Na2S溶液  精確稱取1克Na2S 9H2O置于100mL厭氧瓶中，加入99mL無氧無菌水。 

（2）10% NaHCO3溶液  精確稱取10克NaHCO3置于100mL厭氧瓶中，加入90mL無氧無菌水。 

（3）0.1%的刃天青溶液  精確稱取0.1克刃天青，用無水乙醇適量充分溶解后，用100mL容量瓶定容**100mL。 

4、材料 

厭氧消化器沉積物。 四、實驗方法 

(一)無氧N2、H2、CO2的制備 1、原理 

運用Hungate銅柱除氧系統獲得無氧氣體。銅柱是一個內部裝有銅絲（單質Cu呈亮黃色，CuO呈黑黃色）的硬質玻璃管。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。此管的大小為直徑40mm，長約400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶。加熱帶通電溫度升**約350℃時，向氧化狀的銅柱通入H2時，H2與CuO中的O2結合形成H2O，而CuO被還原成了Cu，銅柱內的Cu呈現明亮的黃色。當來自鋼瓶含有微量O2的N2、CO2、H2通過銅柱時，Cu和氣體中的微量O2化合生成CuO，氣體中微量的氧氣被消耗掉，從出管口出來的則為無氧氣體，而銅柱則由明亮的黃色逐漸變為黑色。應用無氧氣流驅趕厭氧管或厭氧瓶中的空氣從而獲得無氧環境。反復上述過程，銅柱則可反復使用。 

2、方法 

（1）打開Hungate銅柱除氧系統的的通氣橡皮管的止水夾子，開啟氫氣鋼瓶并形成氣流，流出的氫氣用橡皮管引出室外，接通電熱套電源，大約20min后，銅柱溫度能達到350℃左右，銅柱內的銅絲被氫氣還原，由黃黑色變為純銅錚亮色（CuO＋H2   

Cu＋H2O），當銅柱里面的水蒸氣被排出完全后，可關閉氫氣鋼瓶，壓力表指針降為零，銅柱還原結束。用止水夾子將通氣橡皮管密閉待用。 

（2）當需要使用無氧氮氣時，打開氮氣鋼瓶，氣流大小以把針頭對準操作者手背5cm距離明顯感覺到氣流為宜，并隨時注意氣流是否足夠。此時銅柱內的銅絲處于還原態的單質銅，當通入高純氮（99.999%）時，其中所含的極微量氧與單質銅反應，被固定下來（形成氧化銅），同時柱內會產生水蒸氣，氧化銅與氫氣反應所致，流出銅柱的則是無氧氮氣。使用完畢后，先關緊氮氣鋼瓶，使壓力表的指示針回**零位，接著用止水夾封閉所有橡皮管。無氧氫氣、二氧化碳的使用方法相同。 

注意：在進行銅柱還原通氫氣的時候必須打開窗戶，一定熄滅操作臺邊上所有明火，包括酒精燈和電爐，操作室內不得有明火（如抽煙、使用火柴、火機等）。 #p#分頁標題#e#

(二)無氧無菌水的配制 

1、將500mL一定濃度的NaCl水溶液（防止稀釋時細胞漲破）沿玻璃棒倒入固定在鐵架臺上的1000mL三角燒瓶中（選擇合適的圓底燒瓶，水不可太滿，否則水沸騰時容易濺出），**好放入幾個防爆玻璃珠。向500mL水中加入終濃度為0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5mL 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(終濃度0.5‰)。在燒瓶外壁溶液水平面處劃一刻度后，加入適量水（因為蒸發會損失部分水分）。煮沸5～10min（視所加水總量而定），刃天青會根據水中含氧量的下降經歷紫色-紅色-無色的顏色變化，當溶液變為無色后，再煮沸5min，然后通高純氮氣1-2min（趕走空氣）。 

2、分裝的過程可以不用繼續加熱，用10mL的定量注射針筒抽進氮氣流，再打出（三次以上）洗氣，然后抽取9mL無氧水注入已換氣的15mL厭氧管中（抽取注射過程中應迅速利落，與空氣接觸時間應縮****短）；注入厭氧管后，需要等待通氣5s～10s，以置換瓶中空氣，在抽出氮氣流針頭的同時塞緊異丁烯橡膠塞（操作要*：抽出針頭時要注意，橡膠塞應該先半扣到瓶口，然后用右手食指撳住，左手捏住通氣針頭慢慢抽出針頭，橡膠塞可能會外翻導致漏氣等，此時將針頭往瓶內伸使塞子恢復原樣，有時需要反復多次，視塞子大小而定，**后拔出針頭，拔出同時立即將塞子塞進管口），**后旋緊蓋子。 

3、上述無氧水經121℃高壓蒸汽滅菌20min后則獲得無氧無菌水。 （三）厭氧菌液體培養基配制（以制備1000mL為例）

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